К ВОПРОСУ О МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМАХ ВОЗНИКНОВЕНИЯ АСИММЕТРИИ МОЗГА В ПРОЦЕССЕ РАЗВИТИЯ АКВАРИУМНОЙ РЫБКИ ДАНИО (Danio rerio)
Корж В. П.
Институт молекулярной и клеточной биологии, Сингапур. vlad@imcb.a-star.edu.sg
В общем асимметрия мозга представляет собой частный случай асимметрии всего организма, но может возникать и независимо от остальных частей тела. Это предполагает существование регуляторных генов ответственных за формирование симметрии как всего организма, так в частности и мозга. В настоящее время изучение формирование каскадов регуляторных генов проводят на модельных животных. Небольшая аквариумная рыбка данио (Danio rerio) была применена в лабораторных исследованиях в качестве генетической модели в США в 1989-х годах. В настоящее время она широко используется во всем мире. Привлекательность данио в качестве модельного организма может быть отнесена за счет сравнительно небольшого генома, относительного короткого периода репродукции (3-4 месяца), практически стремительного развития вне материнского организма (всего несколько дней) и почти неограниченного количества оптически прозрачных эмбрионов получаемых еженедельно от каждой самки (200-1000). Эта модель используется для массового изучения паттернов экспрессии регуляторных генов в процессе развития мозга.
Сигнальный каскад регулируемый геном Нодал (Nodal) является одним из самых ранних в развитии животных и его нарушения у мышей после нокаута вызывают раннюю гибель зародышей вследствие отсутствия мезодермы. У данио эта функция зависит по крайней мере от двух генов – более раннего Squint и более позднего Cyclops, роли которых частично перекрываются. Несколько лет тому назад в моей лаборатории ген Cyclops был клонирован. Оказалось, что он экспрессируется как а зачатках осевых органов так и асимметрично в левой половине латеральной мезодерме и позже в левой части эпиталамуса соответствующей хабенуле (habenula) (Sampath et al., 1998; Фиг. 1). Эта статья по сути дела предопределила направление исследований в этой области на несколько последующих лет. Стало ясно, что латерализация всего тела и в том числе мозга зависит от генов таких как flh (floating head) и ntl (no tail – Brachyury) связанных с «организатором», формированием первичной оси организма и потоком жидкости в организаторе (у млекопитающих) или Купферовом пузырьке (у рыб).
Транспозон Tol2 активен даже когда размер всей конструкции достигает 10 тыс.пар оснований. Tol2 относится к семейству транспозонов hAT (hobo/Ac/Tam3). Модифицированный неавтономный Tol2 в присутствии Tol2 транспозазы приобретает способность перемещаться в геноме половых клеток данио (Kawakami et al., 2000). К настоящему времени создан мини-Tol2, который состоит из терминальных повторов каждый из которых включает чуть более 200 пар оснований. Мини-Tol2 способен без потери эффективности трансгенеза переносить вставки порядка 10 т. п. о. (Steve Ekker, personal communication).
Недавно транспозон Tol2 был применен в нашей лаборатории для поиска энхансеров (Parinov et al., 2004). Для этого в Tol2 был вставлен ген зеленого флуоресцентного белка (ЗФБ) под контролем относительно слабого мини-промотера эпителий-специфичного кератина-8. После инъекции ДНК транспозона на плазмиде в присутствии РНК транспозазы и инсерции транспозона энхансеры проявляют себя посредством экспрессии гена-маркера, например кодирующего флуоресцентный белок. Эта конструкция обладает сравнительно низким фоном базальной экспрессии ЗФБ вероятно из-за присутствия слабого промотера. В то же время она довольно чувствительна в отношении энхансеров; 75% рыб - первичных носителей трансгена дали начало трансгенным линиям с ярко выраженной тканеспецифической экспрессией ЗФП вне кожи при относительно высоком уровнем экспрессии по сравнению с другими конструкциями. Так в нашей лаборатории в небольшом по масштабам пробном трансгенном скрининге энхансеров мы наблюдали эффективность трансгеноза на уровне 16% отобрав более 30 интересных трансгенных линий. Идентификация мест вставки транспозона в геном производилась путем ПЦР.
И хотя в каждой из трансгенных линий экспрессия ЗФП может выявлять только частичный паттерн экспрессии определенного гена, все вместе эти линии предлагают многочисленные возможности изучать формирование различных типов клеток и органов. Вдобавок цитоплазматическая локализации ЗФБ позволяет детальный анализ клеточной архитектуры включая самые тонкие отростки клеток, например, нейриты. Следовательно ЭТ линии представлют собой замечательные орудия для детального анатомического анализа. С их помощью уже удалось идентифицировать и описать анатомические структуры ранее неизвестные у данио.
Количество ЭТ линий постоянно растет поскольку ими уже начали пользоваться в качестве «стартовых площадок» для инициации транспозиции транспозона в новое положение после инъекции в эмбрионы этих линий мРНК транспозазы (Parinov et al., 2004). Имея ввиду легкость идентификации места инсерции транспозона этот метод предоставляет возможность создания карты примерного расположения энхансеров в геноме и таким образом позволяет глубже понять роль некодирующих участков ДНК.
