НАРУШЕНИЕ ДЕГРАДАЦИИ ЭСТРОГЕНОВОГО РЕЦЕПТОРА a В ПРОТЕАСОМЕ ПРИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА
Т.А. Ишунина*, Д.Ф. Свааб**, И.Н. Боголепова***
Кафедра гистологии Курского государственного медицинского университета, г. Курск*, Netherlands Institute for Neurosciences, Amsterdam, The Netherlands**, ГУ НИИ мозга РАМН, г. Москва***
Принимая во внимание, что ЭРa - убиквитинированный белок, подвергающийся деградации в протеасоме [Nawaz et al., 1999], мы проверили гипотезу о том, что увеличение содержания ядерных ЭРa при болезни Альцгеймера (БоАл), описанное нами ранее [Ishunina and Swaab, 2001], может быть обусловлено его нарушенным протеолизом в протеасоме. С этой целью, холинэргические ядра от случаев с БоАл, в которых обнаружено значительное повышение ЭРa, были окрашены на убиквитин В+1 (УБИВ+1). УБИВ+1 - маркер сниженной активности протеасомы, сопровождающейся неэффективной деградацией аберрантных белков [van Leeuwen et al., 2000]. Следует отметить, что нарушенная убиквитинизация неправильно свёрнутых белков типична для мозга при БоАл, и что, УБИВ+1 был ранее обнаружен в мозге при БоАл [Van Leeuwen et al., 2000].
Материал и методика. Исследование проведено на материале аутопсий 10 случаев с БоАл и 9 контрольных случаев. Гипоталамусы, содержащие основные холинэргические ядра передне-базального мозга (вертикальное ядро диагонального поля Брока (ВЯДБ) и базальное ядро Мейнерта (БЯМ)) фиксировались в 4% параформальдегиде в фосфатном буфере, затем были дегидратированы в спиртах восходящей концентрации, залиты в парафин и порезаны на серийные фронтальные срезы толщиной 6 мкм.
Антитела, распознающие мутантный белок УБИВ+1, были любезно предоставлены доктором F. Van Leeuwen (Netherlands Institute for Neurosciences), а их специфичность описана в работах [Fischer et al., 2003; Van Leeuwen et al., 1998]. Депарафинированные срезы, содержащие ВЯДБ, БЯМ и гипоталамические туберомамиллярное (ТМЯ) и медиальное мамиллярное (ММЯ) ядра, инкубировали в растворе этих антител, разведенных 1:400, в течении 1.5 часа при комнатной температуре и при 40 в течение ночи с последующим окрашиванием пероксидазо-антипероксидазным методом. Соседние срезы окрашивались на ЭРa авидин биотиновым методом [Ishunina and Swaab, 2001].
Результаты исследования и их обсуждение. Иммунореактивный УБИВ+1 выявлялся в виде компактных телец округлой формы, напоминающих нейрофибриллярные клубки. Наиболее интенсивным окрашивание УБИВ+1 оказалось в БЯМ и ТМЯ при БоАл. Значительно меньшее количество нейронов, экспрессирующих УБИВ+1, было обнаружено в ВЯДБ и ММЯ, где характер окрашивания был более диффузным, с преимущественной ко- локализацией в цитоплазме. УБИВ+1 наблюдался в ядре и отростках нейронов, например, в дендритах. Немаловажно, что УБИВ+1 и ядерные ЭРa редко локализуются в одном и том же нейроне. Даже в случае обнаружения в одних и тех же нейронах, ЭРa и УБИВ+1 находятся в различных компартаментах цитоплазмы. При этом окрашивание УБИВ+1 в контрольных случаях либо отсутствует, либо значительно уменьшено, но в некоторых пожилых случаях отмечено интенсивное цитоплазматическое окрашивание.
ЭРa человека – убиквитинированный белок, подлежащий протеолизу в протеасоме - нелизосомальном пути деградации регуляторных коротко живущих белков [Nawaz et al., 1999; Preisler-Mashek et al., 2002; Mengual et al., 1996]. Убиквитин-протеасомная система состоит из протеасомального комплекса 26S, представленного каталитической сердцевиной 20S для протеолиза белков и двух АТФ-содержащих регуляторных частиц 19S, распознающих субстраты, меченые полиубиквитином [Fan et al., 2004]. На внутриклеточном уровне, протеасома локализована в ядре, в цитоплазме, а также в дендритах и аксонах [Mengual et al., 1996; Klimaschewski, 2003], что совпадает с собственными наблюдениями иммунореактивного УБИВ+1 в настоящей работе. В цитоплазме она может быть обнаружена в свободном состоянии, либо в ассоциации с эндоплазматической сетью и компонентами цитоскелета [Mengual et al., 1996]. Связывание с лигандом приводит к протеолизу ЭРa в протеасоме и быстрому снижению его уровня [Fan et al., 2004]. Ингибиторы протеасомы MG132 и лактацистин блокируют опосредованную лигандом деградацию ЭРa, стимулируют накопление высокомолекулярных форм ЭРa, стабилизируют белковую структуру ЭРa и предотвращают активированную 17b-эстрадиолом транскрипцию [Nawaz et al., 1999; Preisler-Mashek et al., 2002; Tateishi et al., 2004; Tsai et al., 2004]. Следует отметить, что деградация в протеасоме не является существенно необходимой для транскрипционной активности ЭРa, а лишь ограничивает транскрипцию, индуцированную 17b-эстрадиолом [Fan et al., 2004]. Стимуляция транскрипционной активности ЭРa связана с убиквитинизацией и протеасомной деградацией рецептора, в то время как блокирование деградации ЭРa, индуцированной лигандом, приводит к пролонгированной стимуляции транскрипции ЭРa-чувствительных генов [Fan et al., 2004]. Для феномена увеличения ядерных ЭРa при БоАл [Ishunina and Swaab, 2001] это означает, что ЭРa-чувствительные гены могут подвергаться пролонгированной стимуляции эстрогенами в случае наличия последних. С другой стороны, не связанные с лигандом ЭРa также подлежат опосредованному протеасомой кругообороту через другой механизм с вовлечением белкового комплекса CHIP [Tateishi et al., 2004]. Следует отметить, что транскрипция ЭРa может осуществляться и через механизм с участием протеин киназы А (РКА), не требующий протеасомной активности и предотвращающий рецептор от лиганд-опосредованной деградации [Tsai et al., 2004]. Интересно, что широко известный ингибитор протеасомы лактацистин прекращает транскрипцию ЭРa, стимулированную 17b-эстрадиолом, и в то же время не влияет на транскрипцию ЭРa, активированную форсколином, действующим через РКА [Tsai et al., 2004]. В этом отношении важно помнить, что быстрые эффекты эстрогенов, осуществляемые посредством активизации калиевых каналов в центральной нервной системе через G-белки и требующие непосредственного участия PKA and PKC [Kelly et al., 2002], не зависят от протеасомы. Не исключено, что при БоАл эстрогены могут действовать и через эту систему, если она не повреждена.
Учитывая тот факт, что УБИВ+1 экспрессируется в гораздо большей степени при БоАл, чем в контрольных случаях, мы считаем оправданным предположение о том, что пост-трансляционная модификация ЭРa убиквитином, его последующая деградация в протеасоме и транскрипционная активность ЭРa повреждены в гипоталамусе и передне-базальном мозге при БоАл. Однако, дисфункция протеасомы не проясняет до конца механизм увеличения экспрессии ЭРa при БоАл. Во-первых, не обнаружено последовательной (закономерной) ко-локализации УБИВ+1 и ЭРa. Во-вторых, существует возможность того, что регуляция ЭРa на транскрипционном уровне также нарушена при БоАл. Следует отметить и тот факт, что экспрессия УБИВ+1 в нейронах – довольно позднее (отдалённое) последствие нарушения функции протеасомы. Это говорит о том, что увеличение содержания ЭРa в ядрах нейронов всё-таки может быть связано с нарушенной деградацией рецептора в протеасоме на более ранних (по сравнению с появлением УБИВ+1) стадиях её повреждения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ishunina TA, Swaab DF. 2001 Increased expression of estrogen receptor a and b in the nucleus basalis of Meynert in Alzheimer's disease. Neurobiol Aging 22:417-426.
2. Van Leeuwen FW, Fischer DF, Kamel D, Sluijs JA, Sonnemans MAF, Benne R, Swaab DF, Salehi A, Hol EM. 2000 Molecular misreading: a new type of transcript mutation expressed during aging. Neurobiol Aging 21: 879-891.
3. Van Leeuwen FW, De Kleijn DP, Van den Hurk HH, Neubauer A, Sonnemans MA, Sluijs JA, Köycü S, Ramdjielal RD, Salehi A, Martens GJ, Grosveld FG, Peter J, Burbach JP, Hol EM. 1998 Frameshift mutants of b amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer’s and Down patients. Science 279: 242-247.
4. Fischer DF, de Vos RAI, van Dijk R, de Vrij FMS, Proper EA, Sonnemans MAF, Verhage MC, Sluijs JA, Hobo B, Zouambia M, Jansen Steur ENH, Kamphorst W, Hol EM, van Leeuwen FW. 2003 Disease-specific accumulation of mutant ubiquitin as a marker for proteasomal dysfunction in the brain. FASEB J 17:2014-2024.
5. de Vrij FMS, Sluijs JA, Gregori L, Fischer DF, Hermens WTJMC, Goldgaber D, Verhaagen J, van Leeuwen FW, Hol EM. 2001 Mutant ubiquitin expressed in Alzheimer’s disease causes neuronal death. FASEB J 15:2680-2688.
6. Kelly MJ, Qiu J, Wagner EJ, Ronnekleiv OK. 2002 Rapid effects of estrogen on G protein-coupled receptor activation of potassium channels in the central nervous system (CNS). J Steroid Biochem Mol Biol 83: 187-193.
7. Klimaschewski L. 2003 Ubiquitin-dependent proteolysis in neurons. News Physiol Sci 18: 29-33.
8. Nawaz Z, Lonard DM, Dennis AP, Smith CL, O’Malley BW. 1999 Proteasome-dependent degradation of the human estrogen receptor. Proc Natl Acad Sci USA 96:1858-1862.
9. Mengual E, Arizti P, Rodrigo J, Giménez-Amaya JM, Castaňo JG. 1996 Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. J Neurosci 16: 6331-6341.
10. Preisler-Mashek MT, Solodin N, Stark BL, Tyriver MK, Alarid ET. 2002 Ligand-specific regulation of proteasome-mediated proteolysis of estrogen receptor-a. Am J Physiol Endocrinol Metab 282: E891-E898.
11. Fan M, Nakshatri H, Nephew KP. 2004 Inhibiting proteasomal proteolysis sustains estrogen receptor-a activation. Mol Endocrinol 18: 2603-2615.
12. Wijayaratne AL, McDonnell DP. 2001 The human estrogen receptor-a is a ubiquitinated protein whose stability is affected differentially by agonists, antagonists, and selective estrogen receptor modulators. J Biol Chem 276: 35684-35692.
13. Tateishi Y, Kawabe Y-I, Chiba T, Murata S, Ichikawa K, Murayama A, Tanaka K, Baba T, Kato S, Yanagisawa J. 2004 Ligand-dependent switching of ubiquitin-proteasome pathways for estrogen receptor. EMBO J 23: 4813-4823.
14. Tsai H-W, Katzenellenbogen JA, Katzenellenbogen BS, Shupnik MA. 2004 Protein kinase A activation of estrogen receptor a transcription does not require proteasome activity and protects the receptor from ligand-mediated degradation. Endocrinology 145: 2730-2738.